亚致死损伤的时间推移检测 通过对荧光报告基因和dsRed OT1 CTL进行共注册，以以下帧间隔和持续时间检测CTL-靶细胞相互作用和亚致死损伤：GCaMP6s持续12小时，帧间隔为8-12秒；NLS-GFP持续30小时，帧间隔为2分钟。用于监测CTL与表达Apple-53BP1trunc的靶细胞结合情况（与dsRed2在光谱上重叠），记录未标记wt OT1 CTL的透射对比度和Apple-53BP1trunc的荧光信号，时间间隔为5-10分钟，持续48小时（Leica SP8 SMD共聚焦显微镜）。每个激发线的激发限制为0.05 mW（561 nm用于Histone-2B-mCherry、Apple-53BP1trunc和dsRed2；488 nm用于GCaMP6s和NLS-GFP）。通过与亮场成像进行比较，验证了长期成像过程中CTL和靶细胞的存活性：CTL迁移速度稳定；CTL形态完整性始终保持，无多个细胞死亡现象；与亮场图像相比，增殖状态未受干扰。使用ImageJ/FIJI进行手动或半自动图像分割和强度分析，识别与CTL相关的损伤事件。
通过旋转盘共聚焦显微镜（BD Pathway）监测OT1 CTL和靶细胞中的Ca2+信号，在Fura2标记的OT1 CTL与表达GCaMP6s的B16F10/OVA细胞的3D共培养过程中进行。Fura2（340/380 nm）采用95秒的帧速率拍摄，GCaMP6s（488 nm）激发采用8秒。为了考虑光毒性和漂白效应，成像时间限制为1小时。
内容由零声教学AI助手提供，问题来源于学员提问
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