亚致死损伤的时间推移检测 通过对荧光报告基因和dsRed OT1 CTL进行共注册,以以下帧间隔和持续时间检测CTL-靶细胞相互作用和亚致死损伤:GCaMP6s持续12小时,帧间隔为8-12秒;NLS-GFP持续30小时,帧间隔为2分钟。用于监测CTL与表达Apple-53BP1trunc的靶细胞结合情况(与dsRed2在光谱上重叠),记录未标记wt OT1 CTL的透射对比度和Apple-53BP1trunc的荧光信号,时间间隔为5-10分钟,持续48小时(Leica SP8 SMD共聚焦显微镜)。每个激发线的激发限制为0.05 mW(561 nm用于Histone-2B-mCherry、Apple-53BP1trunc和dsRed2;488 nm用于GCaMP6s和NLS-GFP)。通过与亮场成像进行比较,验证了长期成像过程中CTL和靶细胞的存活性:CTL迁移速度稳定;CTL形态完整性始终保持,无多个细胞死亡现象;与亮场图像相比,增殖状态未受干扰。使用ImageJ/FIJI进行手动或半自动图像分割和强度分析,识别与CTL相关的损伤事件。
通过旋转盘共聚焦显微镜(BD Pathway)监测OT1 CTL和靶细胞中的Ca2+信号,在Fura2标记的OT1 CTL与表达GCaMP6s的B16F10/OVA细胞的3D共培养过程中进行。Fura2(340/380 nm)采用95秒的帧速率拍摄,GCaMP6s(488 nm)激发采用8秒。为了考虑光毒性和漂白效应,成像时间限制为1小时。
内容由零声教学AI助手提供,问题来源于学员提问